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核蛋白WB實驗

簡要描述:WB(核蛋白WB實驗),印跡法(Blotting)是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上,而后利用相應的探測反應來檢測樣品的一種方法。Western Blot是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。

  • 更新時間:2022-12-23
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詳細介紹

蛋白樣品制備的注意事項:

1、細胞數(shù)量達5×106

2、將細胞裂解液再離心,收集上清液,加loading煮樣5min。

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳注意事項:

1、做膠:防止漏膠、進氣泡以及花膠(水封、插梳子和拔梳子)

2、加樣:兩邊加loading,加樣量一樣,加樣時間要盡量短,以免樣品擴散。

3、電泳:將膠夾好放于電泳槽中,加電泳buffer(內(nèi)外面不能聯(lián)通),將電壓調(diào)到90V開始電泳。

轉(zhuǎn)膜注意事項:

1、泡膜:轉(zhuǎn)膜之前將海綿、膠、膜都用預冷的轉(zhuǎn)移buffer浸泡20min。(1.凝膠若是沒在預冷的轉(zhuǎn)膜buffer中浸泡,就會在轉(zhuǎn)膜過程中出現(xiàn)凝膠皺縮,導致出現(xiàn)轉(zhuǎn)移條帶變形。2.PVDF膜具有疏水性,需用甲醇浸泡)

2、轉(zhuǎn)膜順序:陰極碳板+海綿+三濾+膠+膜+三濾+海綿+陽極碳板

3、轉(zhuǎn)膜條件:0.35A 250V 1h40min 冰浴中進行轉(zhuǎn)膜(具體轉(zhuǎn)膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小而定;目的蛋白的分子量越大,需要的轉(zhuǎn)膜時間越長,反之則短)

4、避免直接用手碰雜交膜,使用鑷子。因為手上的蛋白和油脂會影響轉(zhuǎn)膜效率并會使膜臟掉。

5、夾好膜和凝膠后,確定在凝膠/膜和濾紙之間沒有氣泡存在,否則會導致轉(zhuǎn)膜不*。

6、保證膜和濾紙的大小和凝膠*一樣,過大和過小都會影響轉(zhuǎn)膜效率。

7、雞來源的抗體與PVDF和尼龍膜有較強的結合能力,從而產(chǎn)生較高的背景,故如果選擇雞來源的抗體使用硝酸纖維素膜(NC膜)

關于磷酸化蛋白檢測的注意事項:

1、保持待測蛋白處于磷酸化狀態(tài)!在標本提取液中加入足夠的磷酸酶抑制劑(NaF,可以防止去磷酸化),并將標本時刻保持在冰浴中!

2、使用5%的BSA作為封閉試劑!不能使用脫脂奶粉?。ㄒ驗槊撝谭壑泻欣业鞍?,會出現(xiàn)很高的背景)。

抗體保存注意事項:

1、收到抗體后按要求離心后再打開管蓋進行分裝盒保存!

2、對于大部分抗體,比較合適的保存方式是分裝后保存在-20℃

  2.1 分裝的量以一次實驗用完為好,少不能少于10μl每份。因為分裝體積越小,抗體的濃度越可能會受到蒸發(fā)以及管壁吸附的影響。

  2.2 復融后的分裝抗體如果一次用不完,將剩余母液保存在4℃,避免再凍起來!

  2.3 避免將抗體保存在自動除霜冰箱中。

3、大部分抗體收到后4℃短暫保存1-2周對抗體活性是沒有影響的。

4、長期保存,加入疊氮鈉,防止細菌污染。

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