精品无码国产一区二区三区av_久久人妻天天av_搡老熟女老女人一区二区_成人h动漫精品一区二区_中文字幕日本人妻久久久免费

咨詢熱線(微信同號)

18017847121

當(dāng)前位置:首頁  >  技術(shù)文章  >  人非小細胞肺癌裸鼠原位種植轉(zhuǎn)移模型的建立實驗

人非小細胞肺癌裸鼠原位種植轉(zhuǎn)移模型的建立實驗

更新時間:2022-05-14      點擊次數(shù):951

人非小細胞肺癌裸鼠原位種植轉(zhuǎn)移模型的建立:1)探討肺癌遠處轉(zhuǎn)移和阻斷其遠處轉(zhuǎn)移的研究;(2)模擬晚期非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移的自然發(fā)生過程;(3)在活體動物的完整器官內(nèi)評估瘤細胞播散和腫瘤的生長。


實驗方法原理         


將表達GFP的質(zhì)粒pRNAT-U6/Neo轉(zhuǎn)染人肺腺癌細胞A549G418篩選獲得穩(wěn)定表達GFP細胞,對比轉(zhuǎn)染前后細胞的生長活性和成瘤性。將轉(zhuǎn)染后細胞原位種植裸鼠預(yù)定標(biāo)準處死。HE染色和免疫組化檢測轉(zhuǎn)移灶的位置和數(shù)目。利用KODAK  IS2000MM系統(tǒng)檢測腫瘤播散情況。


實驗材料         


BALB c nu nu裸鼠腺癌細胞株A549


試劑、試劑盒        

 

小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液pRNAT-U6 Neo磷酸鈣即用型SP超敏 感免疫組化染色試劑盒DAB Kit 顯色試劑盒甲醛EDTA


儀器、耗材     


熒光顯微鏡光學(xué)顯微鏡


實驗步驟     

   

一、實驗材料準備

 

1.  BALB/c nu/nu裸鼠40只,雄性,4-6周齡,體重18-20 g,無特定病原體(SPF)級飼養(yǎng)。

 

2.  肺腺癌細胞株A549,用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibcobrl公司),5% CO237℃培養(yǎng),常規(guī)傳代。

 

3.  質(zhì)粒和篩選藥物質(zhì)粒pRNAT-U6/Neo(美國Genscript公司),攜帶Neomycin耐藥基因供篩選,在CMV啟動子控制下編碼cGFP作為轉(zhuǎn)染標(biāo)記物。G418(美國Promega公司)800 μg/ml初篩后200 μg/ml維持篩選。

 

二、細胞的轉(zhuǎn)染

 

1.   哺乳動物磷酸鈣轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(美國Promega公司),按照操作指南將質(zhì)粒pRNAT-U6/Neoo轉(zhuǎn)入A549細胞,轉(zhuǎn)染后24~48 h熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。

 

2.  后培養(yǎng)液內(nèi)加G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。


3.  利用平板克隆形成試驗測定細胞克隆形成率>10%后,有限稀釋法獲得表達GFP陽性細胞。

 

4.  1月后收獲轉(zhuǎn)染細胞,常規(guī)傳代培養(yǎng),培養(yǎng)液中加G418(200 μg/ml)維持篩選。

 

5.  測定轉(zhuǎn)染后A549細胞增殖動力學(xué)指標(biāo),對比轉(zhuǎn)染前后A549細胞生長曲線,檢測轉(zhuǎn)染后細胞的生長活性是否受轉(zhuǎn)染的影響。

 

6.  待細胞增殖達一定數(shù)量后,裸鼠皮下注射轉(zhuǎn)染前后細胞,記錄成瘤時間,用公式V=1/2×長×寬 計算腫瘤體積,對比轉(zhuǎn)染前后兩組裸鼠的瘤體大小以檢測成瘤性是否有差別。

 

三、人肺腺癌A549裸鼠原位種植模型的建立

 

1.  取轉(zhuǎn)染后細胞,用不含血清的RMPI 1640培養(yǎng)液沖洗2次并調(diào)整細胞最終濃度為5×106/0.2 ml備用。

 

2.  0.5%的麻醉50 mg/kg)(中國醫(yī)藥上?;瘜W(xué)試劑公司)腹腔注射麻醉裸鼠,用26號針頭吸取細胞懸液0.2 ml注射入裸鼠左側(cè)胸腔,注射過程中注意控制刺入針頭的深度。

 

3.  整個操作過程在細胞收獲后半小時內(nèi)完成,嚴格遵循無菌原則。

 

4.  注射后在KODAK IS2000MM下確認原位種植成功,注射部位為胸腔。

 

5.  注射后繼續(xù)飼養(yǎng),隔天觀察一次并記錄體重。

 

6.  當(dāng)裸鼠出現(xiàn)精神萎靡、呼吸短促、弓背并明顯消瘦,體重較注射Et減輕20%時,頸椎脫位術(shù)處死裸鼠。


7.  開胸觀察,取出器官,用10%甲醛固定保存。

 

四、檢查項目

 

1.  轉(zhuǎn)染后細胞熒光顯微鏡成像轉(zhuǎn)染后2448 h熒光顯微鏡下觀察,確認轉(zhuǎn)染成功。單克隆化過程中鏡下觀察細胞克隆生長情況。

 

2.  活體GFP標(biāo)記成像檢測應(yīng)用KODAK IS2000MM進行活體熒光成像,確認注射部位為胸腔,后間斷應(yīng)用以活體確認瘤細胞的遠處轉(zhuǎn)移。

 

3.  解剖學(xué)與組織學(xué)檢查處死的裸鼠均經(jīng)


詳細解剖學(xué)檢查,取出器官、固定包埋后,以4 tun厚度連續(xù)切片,切片嚴格編號,奇數(shù)號行HE染色,光鏡觀察,以初步確定轉(zhuǎn)移灶。

 

4.  免疫組織化學(xué)染色

 

選擇肺臟、肝臟和腦作為主要研究器官,在HE染色確定轉(zhuǎn)移灶位置的基礎(chǔ)上,取相鄰偶數(shù)號碼的切片進行免疫組化檢測,CEA鼠抗人單克隆抗體(ZM-0062),LRP鼠抗人單克隆抗體(ZM0335)工作液,即用型SP超敏感免疫組化染色試劑盒(sP-9000)、抗原修復(fù)液、DAB Kit顯色試劑盒(zU9032)均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

 

五、統(tǒng)計學(xué)處理

 

細胞的生長活性和腫瘤體積x±s表示,數(shù)值的比較采用方差分析。HE檢測結(jié)果和活體成像檢測結(jié)果的比較用x2檢驗。采用SPSSl30軟件進行統(tǒng)計分析。


上海達為科生物科技有限公司
  • 聯(lián)系人:張
  • 地址:上海市長江南路180號長江軟件園B區(qū)B637室
  • 郵箱:[email protected]
  • 傳真:
關(guān)注我們

歡迎您關(guān)注我們的微信公眾號了解更多信息

掃一掃
關(guān)注我們
版權(quán)所有©2025上海達為科生物科技有限公司All Rights Reserved    備案號:滬ICP備15041491號-2    sitemap.xml    總流量:125763
管理登陸    技術(shù)支持:化工儀器網(wǎng)    
久久婷婷五月综合色奶水99啪| 一边吃奶一边摸做爽视频| 亚洲国产美女精品久久久久∴| 97影院理论午夜伦不卡| 精品成人av一区二区三区| 久久久婷婷五月亚洲97号色| 国产大片黄在线观看私人影院| 亚洲国产精品无码久久青草| 新狼窝色av性久久久久久| 特级毛片在线大全免费播放| 四虎影视成人永久免费观看视频| 欧美黑人疯狂性受xxxxx喷水| 国产成a人亚洲精v品无码性色| 中文人妻熟女乱又乱精品| 丁香五香天堂网| 亚洲中文字幕无码久久| 国产精品免费_区二区三区观看| 欧美freesex黑人又粗又大| 四虎影视成人永久免费观看视频| 无码少妇精品一区二区免费| 丰满人妻妇伦又伦精品国产| 国产激情精品一区二区三区| 精品一区二区三区无码视频| 久久精品www人人做人人爽| 最近的中文字幕在线看视频| 亚洲人成在线观看| 亚洲av男人的天堂在线观看| 女人大荫蒂毛茸茸视频| 亚洲第一页综合图片自拍| 97一区二区国产好的精华液| 久久亚洲精品无码gv| 亚洲午夜成人精品无码| 中文字幕人妻av一区二区| a级毛片毛片免费观看久| 国产成人av一区二区三区在线| 乱人伦人妻中文字幕无码| 又大又粗弄得我出好多水| 少妇精品久久久一区二区三区| 粉嫩av国产一区二区三区| 精品国产一区二区三区av 性色| 肉色丝袜足j视频国产|